ELISA试剂盒检测组织匀浆液的注意事项
背景介绍
酶联免疫吸附测定（ELISA）作为最快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法之一，组织样本的处理和数据的处理方式对于ELISA实验的成功有着非常重要的作用。ELISA检测的样本类型不仅包括常见的血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清，而且包括不常见的尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、精ye、阴道分泌物等。其中组织匀浆、细胞裂解液、粪便、精ye等样本的收集时间、处理方法和保存的差异，会造成获得样品间的蛋白含量差异较大，进而造成后续检测或数据处理上的一些问题，从而会影响到学者判断ELISA实验的结果。下面我们着重介绍一些比较通用的组织匀浆液的制备方法，并通过文献进行列举数据处理的方法，以供大家学习借鉴。
玻璃匀浆器组织匀浆液的制备方法
用4℃预冷的1×PBS（pH7.2-7.4，0.01M，cell culture，货号：P1020）冲洗组织，去除残留血液，并去除组织上的筋膜、脂肪等冗余组织；
称重后将组织用眼科剪刀和镊子剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:5-1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应5-9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，不建议反复冻融超过2次。因为过多的反复冻融可能影响细胞因子含量的稳定性。最后，将组织匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10分钟，取上清检测；
处理样本的过程就是收集细胞因子或目标蛋白的过程，由于细胞因子或蛋白结构容易改变和降解，组织匀浆过程完成后，储存也非常重要，特别需要注意的是，不要反复冻融，样本处理之后可分装密封保存，4度保存应小于1周，-20 度不应超过3个月，-80度不应超过6个月。在标本使用前应室温缓慢均衡溶化，不能进行加热。
超声组织匀浆液的制备方法
提前将剪刀、镊子用75%酒精消毒，然后用预冷的1×PBS涤浸泡，用来剪切、剪碎组织；
对应将要提取蛋白的组织编号，然后给EP管编号，放在冰上进行预冷。用预冷的PBS （0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎；
配置裂解液：提前将蛋白酶抑制剂（货号：P6730）、磷酸酶抑制剂（货号：P1260）、PMSF（货号：P0100）分别按照1:100的体积比加入到RIRP裂解液中，快速摇匀后静置冰上即可；
将剪碎的组织，加入对应体积的裂解液（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的裂解液，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录）；
在冰上，用剪刀将组织剪碎（剪至组织颗粒非常细小，甚至剪成糜状物），然后去超声破碎即可。（超声的条件：仪器：新芝 Scientz-IID；破碎条件：180W超声3s关6s，超声一次时间1min，超声3-4次）；
超声破碎完成后，离心（4℃，12000rpm离心30分钟）；
离心完成后，用移液器吸取上清液至新的EP管中，同时记录蛋白提取液的体积，然后用BCA法测上清蛋白的浓度。
组织匀浆液的蛋白定量必要性
为了避免假阳性的产生
ELISA检测指标众多，某些组织样本如肝脏，肾脏，脑组织等，因为细胞内含有的蛋白复杂多变，可能会造成与检测指标有假阳性反应。所以通过蛋白含量检测，把高浓度（20mg/mL以上）的样本进行稀释至1-2mg/mL，进行判断是否存在假阳性的可能；
为了方便后续的数据处理和比较分析
因为组织块的大小、提取蛋白的效率不同，所以必然提取的组织匀浆液中蛋白含量在一定的范围内变化，或者样本间蛋白含量差异显著。这些都会造成后续数据处理的困难，无法分辨是因为研究处理的影响，还是蛋白含量造成的差异性。因此，大多数学者会继续发掘数据的其余方面，例如，处理组与对照组的含量百分比；每克组织匀浆蛋白中细胞因子含量的比较；联用其余指示性指标进行比较，例如，炎症反应级别、脂肪率、模型差异等进行联合比较分析。
每克肝组织匀浆液蛋白中的TNF-α的含量图
注：图片摘自Borovikova, L., S. Ivanova, M. Zhang, H. Yang, G.I. Botchkina, L.R. Watkins, H. Wang, N. Abumrad, J.W. Eaton, and K.J. Tracey (2000) Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature 405: 458-462 (cites the use of KRC3012 with liver tissue homogenates).
脂多糖刺激处理组和实验组的TNF-α
百分比图
注：数据处理方法为均值与标准差；图片摘自Borovikova, L., S. Ivanova, M. Zhang, H. Yang, G.I. Botchkina, L.R. Watkins, H. Wang, N. Abumrad, J.W. Eaton, and K.J. Tracey (2000) Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature 405: 458-462 (cites the use of KRC3012 with liver tissue homogenates).
组织匀浆液中瘦素与脂肪垫比率的数据联用
比较图
注：图片摘自Lennie, T.A., M.D. Mortman, and R.J. Seeley (2001) Activity of body energy regulatory pathways in inflammation-induced anorexia. Physiology and Behavior 73(4):517-523 (cites the use of KRC0062 with serum and with tissue homogenates).
组织匀浆液进行细胞因子检测的思考
因为目前检测细胞因子的类型越来越多，我们也要重新考虑样本处理适合自己的样本类型，并且适合自己检测的细胞因子类型，例如，检测因子有可能为蛋白酶3（Protease 3）、核糖核酸酶A（核糖核酸酶A）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE/ELA2）等具有酶活性质的细胞因子，在组织匀浆过程中是否添加蛋白酶抑制剂就值得思考；
一些检测细胞因子需要酸化激活处理也需要特别注意，例如转化生长因子-β1（TGF-β1）、肌肉生长抑制素（GDF-8）等，因此在组织匀浆液的pH最好处于6.5-7.5的中性范围；
以上我们介绍的方法只是比较通用的方法学。最后，我们作为科学研究使用，还是需要更多的参考具有代表性、可靠文献中所述的处理方法，避免因为自己样本处理的方式不对，造成ELISA检测的失败，影响检测数据的准确性和真实性。