题目：

Identification and initial functional characterization of lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) in turbot (Scophthalmus maximus L.)

期刊：Developmental & Comparative Immunology

影响因子：3.119

PMID：31176756

作者单位：青岛农业大学

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1.大菱鲆LIMP2基因的鉴定

分子克隆后，获得一个具有1593bp开放阅读框（ORF）的SmLIMP2基因（GenBank登录号：MH748107）。ORF编码530个氨基酸残基，预测分子质量为59.95kDa，理论等电点为6.44。推测得到的SmLIMP2蛋白具有9个蛋白激酶C磷酸化位点、11个酪蛋白激酶II磷酸化位点和10个N-糖基化位点。此外，推测得到的SmLIMP2蛋白有55个带负电的残基（Asp+Glu），52个带正电的残基（Arg+Lys），不稳定性指数为37.18，脂肪族指数为87.49。与其它物种相比，SmLIMP2基因与褐牙鲆的相似性最高，为97.0%，其次是大黄鱼94.9%，虹鳟94.5%，而与褐牙鲆的同源性最高，为92.5%，其次是大黄鱼89.6%，半滑舌鳎94.5%。

2.SmLIMP2基因的基因组结构分析

作者利用大菱鲆基因组数据库研究了SmLIMP2的基因组结构，并与已发表的LIMP2基因对比了外显子/内含子结构。作者发现有趣的是，在人、鼠和鸡中的LIMP2有12个外显子，而硬骨鱼类有13个外显子。而且，人和小鼠的12个外显子完全相同，而鸡中只有两个外显子是与人和鼠是不同的。此外，在硬骨鱼类含有的13个外显子中，大菱鲆和斑马鱼只有1个外显子不同，大菱鲆和鲶鱼只有2个外显子不同，斑马鱼和鲶鱼只有1个外显子不同。

Figure 1

3.系统进化树分析

作者利用MEGA 6对不同物种LIMP2的氨基酸序列进行了系统进化树分析。结果显示，SmLIMP2首先与褐牙鲆聚集，然后依次与大黄鱼、半滑舌鳎、虹鳟聚集。另一个进化枝由鲤鱼（C. carpio）、斑马鱼（D. rerio）和斑点叉尾鮰（I. punctatus）组成。其他较高等的脊椎动物形成了单个进化分支，包括人（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）、鸡（G.gallus）和热带爪蟾（X. tropicalis）。

Figure 2

4.SmLIMP2基因的共线性分析

 通过共线性分析进一步验证了SmLIMP2的鉴定。结果显示，从哺乳动物到脊椎动物的物种中都观察到了LIMP2的相同相邻基因。其中在大菱鲆、鲶鱼、鸡、小鼠和人中观察到SmLIMP2的邻近基因都包含158个螺旋结构域（CCDC158）、序列相似家族47成员E（FAM47E）和具有EF-hand结构域2的蛋白磷酸酶（PPEF2）。然而，N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）只在鲶鱼、鸡、小鼠和人中观察到。

Figure 3

5.SmLIMP2的组织分布

作者采用Real-time PCR的方法，研究了SmLIMP2在大菱鲆皮肤、鳃、肠、血、肝、脾、头肾、脑等8种健康组织中的组织分布规律。结果显示，SmLIMP2在所有被检测的组织中广泛表达，其中，在脑中表达水平最高（26.44倍），其次是肠（9.93倍）和皮肤（6.03倍），而在肝脏中表达水平最低（对照）。

Figure 4

6.细菌攻击后SmLIMP2的表达谱

为了研究SmLIMP2在大菱鲆粘膜组织中的免疫作用，作者用革兰氏阳性菌S.iniae和革兰氏阴性菌V.anguillarum浸泡攻击大菱鲆后，检测了SmLIMP2在大菱鲆粘膜组织（鳃、皮肤和肠）中的表达谱。

在感染S.iniae后，SmLIMP2只在鳃中上调，在皮肤和肠中下调，具体表现为：在腮中，4h快速上升6.97倍，8h快速上升4.06倍，12h迅速恢复到基础水平；在肠中，2h下降幅度最大，达0.17倍，其余时间点迅速恢复到基础水平。在皮肤中，SmLIMP2在2小时下调0.37倍，8小时下调0.68倍。

在V.anguillarum感染后，三种组织中SmLIMP2的表达情况均上调。具体表现为：在腮中，在2小时时检测到最高的上调，上调幅度为7.52倍。在皮肤中，在2小时时上调4.68倍，在12h时上调4.34倍。

Figure 5

Figure 6

7.微生物配体的体外结合

在表达谱分析之后，作者又研究了SmLIMP2与微生物配体的结合能力。rSmLIMP2是从大肠杆菌中纯化出来的一种天然His标记蛋白，并且只有SmLIMP2的胞外区被诱导，在western blot分析中，只观察到一条分子量为50kDa的带。最后，研究了SmLIMP2与微生物配体和虹彩病毒（iridovirus）的结合能力，具体表现为：对照蛋白与被测配体没有任何结合能力，而rSmLIMP2对LPS的结合能力最强，其次是iridovirus、PGN和LT。PGN和LTA均在4μg/ml时达到峰值，而LPS和iridovirus均在8μg/ml时达到峰值。

Figure 7

Figure 8

8.凝集试验

作者用凝集试验进一步鉴定LIMP2的免疫功能。在含钙的TBS缓冲液中的凝集试验表明，rSmLIMP2能够引起大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鳗弧菌强烈的凝集，其中，大肠杆菌和鳗弧菌的凝集作用更强。